簡(jiǎn)要說明

BY4742菌株來(lái)源于釀酒酵母原始菌株——S288C，是實(shí)驗(yàn)室的常用菌株，可直接通過PEG/LiAc將pYES2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入BY4742細(xì)胞內(nèi)。質(zhì)粒pYES2的篩選標(biāo)志為URA，可用SD-URA板板進(jìn)行篩選。BY4742感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pYES2質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>104 cfu/μg DNA。

操作說明：

1、取一支無(wú)菌的1.5ml EP管，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒1-3µg，Carrier DNA 10µl(95-100 度5min 快速冰浴，重復(fù)一次)，100µl冰上融化的AH109感受態(tài)細(xì)胞，PEG/LiAc500µl，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次； 

2. 30℃水浴30min，每10min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

3. 每支加入20µl的二甲基亞砜；（用于提高轉(zhuǎn)化效率，可不做）

4. 42℃水浴15min，每5min輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次；

5. 12000rpm瞬時(shí)離心棄上清，每支加入1ml的YPDPlus于30℃復(fù)蘇1h；（用于提高轉(zhuǎn)化效率，可不做）

6. 12000rpm瞬時(shí)離心棄上清，用100µl 0.9%NaCl重懸，涂板，30℃培養(yǎng)48-96h。

注意事項(xiàng)

1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。

2. 若使用pYES2質(zhì)粒表達(dá)蛋白，需在培養(yǎng)基中加入2%的半乳糖（篩選培養(yǎng)基中不用加半乳糖；當(dāng)需要目的蛋白表達(dá)時(shí)，需加入半乳糖代替葡萄糖作為碳源），以誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。

3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4. 同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

5. 酵母為真核生物，不易長(zhǎng)期保存，隨感受態(tài)在-80℃保存時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率會(huì)不斷下降，建議保存時(shí)間不超過90天。

6. BY4742酵母菌株對(duì)高溫敏感，最適生長(zhǎng)溫度為27-30℃；高于31℃，生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。

7. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長(zhǎng)越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克?。煌縎D單缺平板29℃，48-60h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。