基因型

F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3) pRARE(argU，argW，ileX，glyT，leuW，proL)(CamR)

簡(jiǎn)要說明

Rosetta(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞具有l(wèi)u霉素抗性，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6 種稀有密碼子(AUA，AGG， AGA， CUA，CCC，GGA) 對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平，該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū)（DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶），同時(shí)表達(dá)T7RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率高達(dá)108cfu/μg。

操作說明

1、取100μl冰上融化的 Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，加入目的質(zhì)粒并輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基（2YT或LB），混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT 或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。

2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4.誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2mM均可）。

5.為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。